actinomycetes culture method 방선균 배양법
방선균은 선택적 한천 배지와 연속 희석법을 이용해 배양하며, 성장 속도가 느려 보통 28℃에서 30℃ 사이에서 7일에서 14일 정도 배양해야 됩니다.
핵심배지와 분리 방법
1. 시료준비 : 토양 또는 해양 퇴적물 시료(예 : 1g 또는 10g)를 멸균 식염수나 증류수에 현탁시킨 후, 일반적으로 10⁻⁴에서 10⁻⁴까지 연속 희석을 수행합니다.
참조) 곤충류가 많이 죽어있는 산흙 중에 낙엽류를 제거하고 20cm 내외의 흙+유기물을 채취한다.
2. 선택배지 : 빠르게 자라는 박테리아와 곰팡이를 억제하면서 느리게 자라는 방선균을 선호하도록 설계된 배지를 사용하세요.
1) 전분 카제인 한천(CSA): 복합탄수화물과 높은 탄소 대 질소 비율을 제공합니다.
2) 방선균 분리 한천 배지(AIA) : 소듐 카제인산나트륨과 글리세롤을 사용하며, 사이클로헥시미드나 니스타틴 같은 항진균제를 보충제로 첨가합니다.
3) 키틴 한천 : 복합 당을 가수분해할 수 있는 생물만 이용할 수 있는 선택적 기질로서 키틴을 활용합니다.
3. 접종 및 배양 : 희석한 시료를 한천 배지에 도말을 하거나 줄무늬로 펴 바른 후 28~30℃에서 7~14일간 배양합니다.
4. 군집 식별 : 특정적인 단단하고 건조하며 분필 같거나 가루 같은 군락이 한천 표묜에 단단히 붙아 있는지
확인하세요.(종종 흙냄새나 지오스민 냄새가 동반됩니다)
5. 형태학 연구 : 슬라이드 배양법이나 커버글라스 삽입법 같은 전문 기법을 사용해 현미경으로 포자 사슬 배열을 관찰하세요.
Actinomycetes are cultured using selective agar media like Starch Casein Agar or Actinomycetes Isolation Agar after pretreating soil samples through serial dilution and incubation at 25°C to 30°C for 7 to 14 days.
1. Sample Preparation and Pretreatment
• Collection: Gather dry soil or sediment samples.
• Pretreatment: Dry the soil at room temperature or heat it lightly (e.g., 50°C–55°C for 10–15 minutes) to reduce unwanted fast-growing bacteria.
• Dilution: Mix 1 g of soil with 9 mL or 10 mL of sterile saline/water, then perform serial dilutions (up to 10⁻⁴ or 10⁻⁵).
2. Culture Media
• Selective Media: Use Starch Casein Agar (SCA), Actinomycetes Isolation Agar (AIA), or Chitin Agar.
• Supplements: Add antifungal agents like cycloheximide or nystatin (50 mg/L) to the agar media to prevent fungal overgrowth.
3. Inoculation and Incubation
• Inoculation Method: Spread or streak 0.1 mL of the diluted soil suspension onto the surface of the selective agar plates.
• Incubation Conditions: Incubate the plates inverted at 25°C to 30°C for 7 to 14 days (slow growth requires patience).
4. Colony Identification and Purification
• Appearance: Look for dry, chalky, tough, or leathery colonies that often adhere tightly to the agar surface, frequently with powdery aerial spores.
• Sub-culturing: Pick single, distinct colonies and streak them onto fresh Glucose Yeast Extract Agar or ISP-2 medium to obtain a pure culture.
<출처 구글>